5.3. PH¦¥NG PH¸P  S¾c ký láng

S¾c ký láng lµ ph­¬ng ph¸p t¸ch s¾c ký c¸c chÊt dùa trªn sù ph©n bè kh¸c nhau cña chóng gi÷a hai pha kh«ng trén lÉn, trong ®ã pha ®éng lµ mét chÊt láng ch¶y qua pha tÜnh chøa trong cét.

S¾c ký láng ®­îc tiÕn hµnh chñ yÕu dùa trªn c¬ chÕ hÊp phô, ph©n bè khèi l­îng, trao ®æi ion, lo¹i trõ theo kÝch th­íc hoÆc t­¬ng t¸c ho¸ häc lËp thÓ.

ThiÕt bÞ

ThiÕt bÞ bao gåm mét hÖ thèng b¬m, bé phËn tiªm mÉu, cét s¾c ký (bé phËn ®iÒu khiÓn nhiÖt ®é cã thÓ ®­îc sö dông nÕu cÇn thiÕt), detector vµ mét hÖ thèng thu d÷ liÖu (hay mét m¸y tÝch ph©n hoÆc mét m¸y ghi ®å thÞ). Pha ®éng ®­îc cung cÊp tõ mét hoÆc vµi b×nh chøa vµ ch¶y qua cét, th«ng th­êng víi tèc ®é kh«ng ®æi vµ sau ®ã ch¹y qua detector.

HÖ thèng b¬m

HÖ thèng b¬m trong s¾c ký láng ph¶i gi÷ cho pha ®éng lu«n ch¶y víi mét l­u l­îng kh«ng ®æi. Nh÷ng biÕn ®æi ¸p suÊt sÏ ®­îc gi¶m thiÓu, vÝ dô cho dung m«i ch¹y qua mét thiÕt bÞ gi¶m xung. èng dÉn vµ hÖ thèng nèi ph¶i lµ lo¹i chÞu ®­îc ¸p suÊt sinh ra do hÖ thèng b¬m. C¸c b¬m cã thÓ ®­îc l¾p víi thiÕt bÞ lo¹i bá bät khÝ.

HÖ thèng ®iÒu khiÓn b»ng bé vi xö lý cã kh¶ n¨ng cung cÊp pha ®éng hoÆc h»ng ®Þnh (röa gi¶i ®¼ng dßng) hoÆc thay ®æi tû lÖ thµnh phÇn (röa gi¶i gradient) theo mét ch­¬ng tr×nh x¸c ®Þnh. Trong tr­êng hîp röa gi¶i gradient, hÖ thèng b¬m lÊy c¸c dung m«i tõ mét vµi b×nh chøa vµ c¸c dung m«i cã thÓ ®­îc trén lÉn ë ¸p suÊt thÊp hoÆc ¸p suÊt cao.                                                                                                                           

Bé phËn tiªm mÉu

Dung dÞch mÉu thö ®­îc ®­a vµo dßng pha ®éng hoÆc vµo vÞ trÝ gÇn ®Çu hoÆc ®Çu cét nhê mét bé phËn tiªm mÉu cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng ë ¸p suÊt cao. Cã thÓ dïng vßng chøa mÉu thö, cã thÓ tÝch cè ®Þnh ho¹c thiÕt bÞ cã thÓ tÝch thay ®æi, cã thÓ vËn hµnh b»ng tay hoÆc tù ®éng. Khi tiªm mÉu b»ng tay cã thÓ g©y ra sai sè do thÓ tÝch tiªm vµo vßng chøa mÉu kh«ng ®ñ                                                                                                                                                                                                    

Pha tÜnh

Cã nhiÒu lo¹i pha tÜnh cã thÓ ®­îc sö dông trong s¾c ký láng, bao gåm:

-          Silica (silic dioxyd), nh«m oxyd hoÆc than ho¹t tÝnh d¹ng xèp th­êng ®­îc dïng trong s¾c ký pha thuËn mµ qu¸ tr×nh ph©n t¸ch dùa trªn sù kh¸c nhau vÒ kh¶ n¨ng hÊp phô hoÆc (vµ) ph©n bè khèi l­îng,

-          Nhùa hoÆc polymer cã chøa c¸c nhãm chøc acid hoÆc base, sö dông trong s¾c ký trao ®æi ion mµ trong ®ã sù chia t¸ch ®­îc thùc hiÖn dùa trªn sù c¹nh tranh gi÷a c¸c ion cÇn t¸ch vµ c¸c ion trong pha ®éng,

-          Silica xèp hoÆc polymer, sö dông trong s¾c ký r©y ph©n tö, ë ®ã sù chia t¸ch dùa trªn sù kh¸c nhau vÒ kÝch th­íc ph©n tö, t­¬ng øng víi sù lo¹i trõ kh«ng gian .

-          RÊt nhiÒu chÊt mang biÕn ®æi ho¸ häc ®­îc chÕ t¹o tõ polymer, silicagel hoÆc than graphit xèp ®­îc dïng trong s¾c ký láng pha ®¶o mµ ë ®ã sù chia t¸ch vÒ nguyªn t¾c c¬ b¶n dùa trªn sù ph©n bè ph©n tö c¸c chÊt gi÷a pha ®éng vµ pha tÜnh.

-          Pha tÜnh lo¹i biÕn ®æi ho¸ häc ®Æc biÖt, vÝ dô dÉn xuÊt cña cellulose hoÆc amylose, protein hoÆc peptid, cyclodextrin vv... dïng ®Ó t¸ch c¸c ®ång ph©n ®èi quang (s¾c ký ®èi quang).

PhÇn lín sù chia t¸ch dùa trªn c¬ chÕ ph©n bè, sö dông silica biÕn ®æi ho¸ häc lµm pha tÜnh vµ c¸c dung m«i ph©n cùc lµm pha ®éng. BÒ mÆt cña chÊt mang, vÝ dô nh­ c¸c nhãm silanol cña silica ®­îc ph¶n øng víi c¸c thuèc thö silan kh¸c nhau t¹o thµnh c¸c dÉn xuÊt silyl cã liªn kÕt céng hãa trÞ, che phñ mét sè l­îng kh¸c nhau c¸c vÞ trÝ ho¹t ®éng trªn bÒ mÆt chÊt mang. B¶n chÊt cña c¸c pha liªn kÕt lµ tham sè quan träng ®Ó x¸c ®Þnh c¸c tÝnh chÊt t¸ch cña hÖ s¾c ký.

C¸c pha liªn kÕt dïng phæ biÕn lµ:

Octyl                         =            Si ­–(CH2)₇–CH₃                                                                   C₈

Octadecyl                    =          Si –(CH2)₁₇–CH₃                    C₁₈

Phenyl                         =          Si–(CH₂)_n– (C₆H₅)                   C₆H₅                                      

Cyanopropyl   =          Si–(CH₂)₃–CN                                      CN

Aminopropyl =          Si– (CH₂)₃–NH₂                                  NH₂

Diol                  =         Si-(CH₂)₃-OCH(OH)-CH₂-OH

Trõ khi cã tiªu chuÈn riªng cña nhµ s¶n xuÊt, th«ng th­êng c¸c cét s¾c ký pha ®¶o dùa trªn silaca ®­îc coi lµ æn ®Þnh ®èi víi pha ®éng cã pH tõ 2,0 tíi 8,0. Cét chøa than graphit xèp hoÆc c¸c h¹t vËt liÖu polymer nh­ styren - divinylbenzen copolymer æn ®Þnh ë mét kho¶ng pH réng h¬n.

Ph©n tÝch sö dông s¾c ký pha thuËn víi pha tÜnh lµ silica kh«ng bÞ biÕn ®æi, than graphit xèp hoÆc silica biÕn ®æi hãa häc lµm cho ph©n cùc (vÝ dô  cyanopropyl hoÆc diol) vµ pha ®éng kh«ng ph©n cùc ®­îc sö dông trong mét sè tr­êng hîp.

§èi víi sù t¸ch nh»m môc ®Ých ph©n tÝch, kÝch th­íc h¹t cña pha tÜnh phæ biÕn nhÊt tõ 3 μm tíi 10 μm. C¸c h¹t cã thÓ h×nh cÇu hoÆc kh«ng cã h×nh d¹ng nhÊt ®Þnh, cã ®é xèp kh¸c nhau vµ diÖn tÝch bÒ mÆt ®Æc hiÖu. Nh÷ng tham sè nµy cÊu thµnh biÓu hiÖn s¾c ký cña tõng pha tÜnh cô thÓ. Trong tr­êng hîp pha ®¶o, c¸c yÕu tè bæ sung nh­ b¶n chÊt cña pha tÜnh, møc ®é liªn kÕt, vÝ dô nh­ ®é dµi m¹ch carbon liªn kÕt, hoÆc c¸c nhãm ho¹t ®éng bÒ mÆt cña pha tÜnh cã ®­îc che phñ hÕt hay kh«ng. Sù kÐo ®u«i pic, ®Æc biÖt cña c¸c chÊt base, cã thÓ x¶y ra khi cã mÆt c¸c nhãm silanol bÒ mÆt cña silica.

Cét ®­îc lµm b»ng thÐp kh«ng gØ trõ khi cã chØ dÉn kh¸c trong chuyªn luËn riªng, cã chiÒu dµi vµ ®­êng kÝnh trong (f) kh¸c nhau ®­îc sö dông cho ph©n tÝch s¾c ký. Cét víi ®­êng kÝnh trong nhá h¬n 2 mm th­êng ®­îc coi lµ vi cét. NhiÖt ®é cña pha ®éng vµ cét ph¶i ®­îc gi÷ æn ®Þnh trong suèt thêi gian ph©n tÝch. PhÇn lín qu¸ tr×nh t¸ch ®­îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é phßng, nh­ng cét cã thÓ ®­îc lµm nãng nh»m thu ®­îc hiÖu qu¶ cao h¬n. Tuy nhiªn, nhiÖt ®é cét còng kh«ng ®­îc phÐp v­ît qu¸ 60 ⁰C v× kh¶ n¨ng ph©n huû cña pha tÜnh hoÆc sù thay ®æi thµnh phÇn cña pha ®éng cã thÓ x¶y ra.

Pha ®éng

§èi víi s¾c ký pha thuËn, th­êng sö dông dung m«i Ýt ph©n cùc. Sù cã mÆt cña n­íc trong pha ®éng ph¶i ®­îc h¹n chÕ vµ kiÓm tra chÆt chÏ nh»m thu ®­îc kÕt qu¶ t¸i lÆp l¹i. §èi víi s¾c ký láng pha ®¶o, sö dông pha ®éng chøa n­íc, cã hoÆc kh«ng cã dung m«i h÷u c¬.

C¸c thµnh phÇn cña pha ®éng th­êng ®­îc läc nh»m lo¹i bá c¸c tiÓu ph©n lín h¬n 0,45 μm. Pha ®éng chøa nhiÒu thµnh phÇn ®­îc chuÈn bÞ b»ng c¸ch ®ong c¸c thÓ tÝch qui ®Þnh (trõ khi cã chØ ®Þnh vÒ khèi l­îng) cña c¸c thµnh phÇn riªng lÎ råi sau ®ã trén lÉn víi nhau. Ngoµi ra, dung m«i còng cã thÓ ®­îc cÊp qua c¸c b¬m riªng lÎ, ®iÒu khiÓn b»ng c¸c van chia tû lÖ thuËn, ®Ó cã thÓ trén lÉn theo c¸c tû lÖ mong muèn. Dung m«i th­êng ®­îc lo¹i khÝ tr­íc khi b¬m b»ng c¸ch sôc khÝ heli, l¾c siªu ©m    hoÆc sö dông hÖ thèng läc mµng läc/ch©n kh«ng trùc tuyÕn nh»m tr¸nh sù t¹o bät khÝ trong cèc ®o cña detector.

Dung m«i dïng ®Ó chuÈn bÞ pha ®éng th­êng kh«ng ®­îc chøa c¸c chÊt lµm æn ®Þnh vµ ph¶i trong suèt (kh«ng hÊp thô quang) ë vïng b­íc sãng ph¸t hiÖn, nÕu nh­ sö dông detector tö ngo¹i. Dung m«i vµ nh÷ng thµnh phÇn kh¸c ®­îc dïng ph¶i cã chÊt l­îng phï hîp. Khi cÇn ®iÒu chØnh pH chØ thùc hiÖn víi thµnh phÇn n­íc cña pha ®éng mµ kh«ng ®iÒu chØnh víi hçn hîp. NÕu sö dông dung dÞch ®Öm, cÇn ph¶i röa hÖ thèng b»ng hçn hîp n­íc vµ dung m«i h÷u c¬ (5% tt/tt) nh»m ng¨n chÆn sù kÕt tinh muèi sau khi kÕt thóc qu¸ tr×nh s¾c ký.

Pha ®éng cã thÓ chøa nh÷ng thµnh phÇn kh¸c, vÝ dô mét ion tr¸i dÊu trong s¾c ký t¹o cÆp ion hoÆc mét chÊt chän läc ®èi quang trong tr­êng hîp s¾c ký sö dông pha tÜnh kh«ng chän läc ®èi quang.

Detector

Detector hÊp thô tö ngo¹i/kh¶ kiÕn gåm c¶ detector chuçi diod lµ ®­îc sö dông phæ biÕn nhÊt. Detector huúnh quang, detector khóc x¹ vi sai, detector ®iÖn ho¸, detector khèi phæ, detector t¸n x¹ ¸nh s¸ng bay h¬i, detector phãng x¹  hoÆc c¸c lo¹i detector ®Æc biÖt kh¸c còng cã thÓ ®­îc sö dông.

C¸c ®¹i l­îng ®Æc tr­ng cho qu¸ tr×nh s¾c ký: Xem Phô lôc 5.8.

 

 

 

Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh

Lµm c©n b»ng cét víi pha ®éng vµ tèc ®é dßng theo qui ®Þnh, ë nhiÖt ®é phßng hoÆc nhiÖt ®é qui ®Þnh trong chuyªn luËn riªng, cho ®Õn khi ®­êng nÒn æn ®Þnh. ChuÈn bÞ c¸c dung dich chuÈn vµ dung dÞch thö theo yªu cÇu. C¸c dung dÞch ph¶i kh«ng ®­îc cã c¸c tiÓu ph©n r¾n.

HiÖu n¨ng

Qui ®Þnh vÒ sù phï hîp cña hÖ thèng ®­îc m« t¶ trong Phô lôc 5.8. C¸c kü thuËt t¸ch s¾c ký. X¸c ®Þnh vµ ®iÒu chØnh c¸c th«ng sè cña hÖ thèng s¾c ký cã thÓ ®­îc thùc hiÖn nh»m ®¸p øng c¸c yªu cÇu vÒ sù phï hîp cña hÖ thèng còng ®­îc tr×nh bµy trong Phô lôc nµy.

Thµnh phÇn vµ tèc ®é dßng cña pha ®éng ®­îc qui ®Þnh trong chuyªn luËn riªng. Pha ®éng lµ hçn hîp dung m«i ®­îc ®uæi khÝ b»ng b¬m ch©n kh«ng hoÆc b»ng mét thiÕt bÞ ®uæi khÝ kh¸c phï hîp nh­ng kh«ng ¶nh h­ëng ®Õn thµnh phÇn cña hçn hîp.

Trong qu¸ tr×nh ®Þnh l­îng, khi trong chuyªn luËn riªng kh«ng qui ®Þnh dïng chuÈn néi, nªn sö dông bé phËn tiªm mÉu cã thÓ tÝch cè ®Þnh. Trong mét sè tr­êng hîp ngo¹i lÖ, khi trong chuyªn luËn chØ dÉn tÝnh theo chiÒu cao pÝc th× kh«ng cÇn quan t©m ®Õn hÖ sè ®èi xøng.

Cét s¾c ký th­êng ®­îc lµm b»ng thÐp kh«ng gØ cã kÝch th­íc (chiÒu dµi x ®­êng kÝnh trong) ®­îc qui ®Þnh trong chuyªn luËn riªng. Trong chuyªn luËn riªng, khi pha tÜnh ®­îc ký hiÖu b»ng mét ch÷ c¸i th× tra cøu ë phÇn Nguyªn vËt liÖu nªu ë d­íi ®©y. §­êng kÝnh danh nghÜa cña h¹t pha tÜnh ®­îc ®Ó trong ngoÆc ®¬n ngay sau ký hiÖu ch÷ c¸i cô thÓ. NÕu kh«ng cã chØ dÉn kh¸c trong chuyªn luËn riªng, qu¸ tr×nh s¾c ký ®­îc tiÕn hµnh ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é kh«ng ®æi trong m«i tr­êng phßng thÝ nghiÖm. Khi sö dông c¸c pha ®éng cã pH cao víi cét cã b¶n chÊt lµ silica nªn sö dông mét tiÒn cét ë tr­íc cét ph©n tÝch.

Trõ khi cã c¸c chØ dÉn kh¸c trong chuyªn luËn riªng, hÖ thèng detector gåm mét detector ®o quang g¾n víi mét cèc ®o cã thÓ tÝch nhá (kho¶ng 10 ml lµ phï hîp). Ph¶i ®Æt b­íc sãng theo chØ dÉn trong chuyªn luËn riªng.

Khi dïng mét m¸y s¾c ký cã thiÕt kÕ riªng biÖt cã thÓ ph¶i thay ®æi c¸c ®iÒu kiÖn s¾c ký ®· ghi trong chuyªn luËn riªng. Trong tr­êng hîp nµy, ng­êi ph©n tÝch cÇn ®¶m b¶o r»ng nh÷ng thay ®æi ®ã cho kÕt qu¶ t­¬ng ®­¬ng.

ThÓ tÝch tiªm

Khi thÓ tÝch tiªm kh«ng qui ®Þnh trong chuyªn luËn riªng, nªn chän mét thÓ tÝch tiªm phï hîp ®Ó ¸p dông. Chän thÓ tÝch tiªm phô thuéc vµo ®¸p øng cña phÐp ph©n tÝch, detector sö dông, hiÖu lùc cét vµ toµn bé hiÖu n¨ng cña hÖ thèng s¾c ký. Khi kh«ng cã chØ dÉn, th­êng dïng thÓ tÝch tiªm lµ 20 ml, tuy nhiªn cÇn kiÓm tra sù thÝch hîp trong ®iÒu kiÖn cô thÓ.

PÝc thø cÊp

Cã thÓ cÇn chÊt ®èi chiÕu ®Ó x¸c ®Þnh pÝc thø cÊp. PÝc thø cÊp lµ mét pÝc cã trªn s¾c ký ®å nh­ng kh«ng ph¶i lµ pÝc chÝnh hay pÝc cña chuÈn néi hoÆc pÝc cña dung m«i hay cña c¸c thuèc thö t¹o dÉn xuÊt.               

Nguyªn vËt liÖu

C¸c dung m«i vµ thuèc thö dïng ®Ó pha c¸c dung dÞch sö dông trong ph©n tÝch ph¶i cã chÊt l­îng thÝch hîp cho s¾c ký láng.

Khi chuyªn luËn riªng quy ®Þnh pha tÜnh ®­îc g¸n víi mét ch÷ c¸i (A hoÆc B hoÆc C) lµ muèn nãi tíi c¸c pha tÜnh nh­ m« t¶ d­íi ®©y:

            Pha tÜnh A, h¹t silica

            Pha tÜnh B, h¹t silica ®­îc biÕn ®æi hãa häc, g¾n víi nhãm octylsilyl (C₈)

            Pha tÜnh C, h¹t silica ®­îc biÕn ®æi hãa häc, g¾n víi nhãm octadecylsilyl (C₁₈)